【摘要】表面等離子體共振(SPR)技術(shù)作為一種強大的生物物理工具，在分子垂釣領(lǐng)域展現出 卓越的應用價(jià)值。分子垂釣是藥物研發(fā)的前沿技術(shù)，在藥物發(fā)現中發(fā)揮著(zhù)重要作用，該技術(shù)憑借其 高靈敏度、高特異性、實(shí)時(shí)活性監測、自動(dòng)化進(jìn)樣和回收能力，結合高分辨質(zhì)譜的鑒定功能，不僅 可以用于從細胞裂解液中篩選和捕獲蛋白質(zhì)等生物大分子，還能應用于中藥和天然產(chǎn)物提取液中小 分子化合物的垂釣。在復雜的粗樣本原液中特異性的垂釣發(fā)掘出高價(jià)值的分子和活性成分的獨特能 力使得分子垂釣技術(shù)成為現代生物醫藥和食品行業(yè)中備受關(guān)注的技術(shù)。本文詳細闡述了基于 SPR 的 分子垂釣技術(shù)原理，全面綜述了其在藥物研發(fā)、生物醫學(xué)研究、中藥成分篩選及作用機制探究等多 個(gè)領(lǐng)域的應用情況，深入探討了實(shí)驗中的關(guān)鍵因素，并對該技術(shù)面臨的挑戰與未來(lái)發(fā)展趨勢進(jìn)行了 展望。 

1、引言 

隨著(zhù)生命科學(xué)與生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，深入了解分子間相互作用機制對于諸多領(lǐng)域的突破至關(guān) 重要。SPR 技術(shù)憑借其能夠實(shí)時(shí)、無(wú)標記且高靈敏地監測分子間結合與解離過(guò)程的特性，成為分子 垂釣的得力手段，為解決復雜的生物學(xué)和藥學(xué)問(wèn)題提供了新途徑。分子垂釣是藥物研發(fā)的前沿技 術(shù)，被廣泛應用于新目標和活性成分的檢測，在藥物發(fā)現中發(fā)揮著(zhù)重要作用，具體的作用包括發(fā)現 未知的新靶點(diǎn)和識別藥物已知的作用位點(diǎn)。此外，當天然產(chǎn)物的目標難以確定時(shí)，分子垂釣技術(shù)可 以識別其有效的單體組分。分子垂釣技術(shù)通過(guò)直接篩選細胞提取物來(lái)尋找和識別可能與誘餌配體相 互作用的分子，為藥物靶點(diǎn)發(fā)現的研究奠定了良好的基礎。 

2、基于 SPR 的分子垂釣技術(shù)原理 

SPR 現象基于金屬薄膜表面等離子體與入射光的共振耦合，當入射光特定角度照射到鍍有金屬 膜(如金膜)的傳感芯片表面，且表面附近介質(zhì)折射率發(fā)生變化時(shí)，會(huì )引發(fā)反射光強度的急劇改 變，通過(guò)監測這一變化可實(shí)時(shí)追蹤分子結合與解離動(dòng)態(tài)?；?SPR 的分子垂釣技術(shù)基本原理就是從 中藥煎劑、中草藥提取物或化合物庫等復雜混合物中“釣取”可以與配體結合的分子。在分子垂釣 應用中，將靶標分子(如蛋白質(zhì)、核酸等)固定于芯片表面，注入含待檢測分子的樣品溶液，若兩者發(fā)生特異性結合，芯片表面折射率改變，SPR 信號響應，垂釣出混合樣品中與靶蛋白結合的分子， 

最后利用質(zhì)譜對回收到的樣品進(jìn)行鑒定[1]。在這些研究中使用 SPR 生物傳感器，可以解決以下任務(wù): (a)基于 SPR 選擇特定生物樣品最有效親和分離所需的固定化條件;(b)基于 SPR 的分子垂 釣，用于隨后通過(guò)質(zhì)譜進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定;(c)基于 SPR 驗證已鑒定蛋白質(zhì)與固定化配體的相互作 用。 

3、基于 SPR 的分子垂釣應用領(lǐng)域 

3.1 藥物研發(fā) 

SPR 技術(shù)可快速篩選大量化合物與潛在靶點(diǎn)蛋白的相互作用。例如，在抗癌藥物研發(fā)中，將癌 相關(guān)蛋白固定于芯片，與小分子化合物庫進(jìn)行垂釣實(shí)驗，能精準定位可抑制該蛋白活性的先導化合 物，測定先導化合物與靶點(diǎn)的親和力常數(KD)、結合速率常數(ka)和解離速率常數(kd)等動(dòng) 力學(xué)參數，直觀(guān)反映結合的緊密程度與穩定性。通過(guò)不斷調整化合物結構并重復垂釣測試，篩選出 親和力更強、藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)更佳的候選藥物，提高藥物研發(fā)成功率,進(jìn)而確定全新的藥物靶點(diǎn)，為 后續藥物設計開(kāi)辟方向[2,3]。如中國科學(xué)院上海有機化學(xué)研究所生物與化學(xué)交叉學(xué)科研究中心團隊[4] 預測 STAT3 為雷帕霉素的直接功能性蛋白質(zhì)靶標，通過(guò)分子垂釣確認該假設，并發(fā)現雷帕霉素同時(shí) 降低 STAT3 和 c-myc 的表達，還在肝細胞癌的異種移植小鼠模型中驗證了結論，為癌癥治療的 STAT3 抑制劑的藥理學(xué)和藥物開(kāi)發(fā)提供重要信息。暨南大學(xué)醫學(xué)院費嘉教授團隊[5]通過(guò) SPR-MS 技術(shù)鑒定小 檗堿作用靶點(diǎn) UHRF1，將小檗堿固定到傳感芯片上，加入細胞裂解液孵育，垂釣靶蛋白并回收，經(jīng)質(zhì) 譜鑒定，確定 UHRF1 為小檗堿的潛在作用靶點(diǎn)，并通過(guò) SPR 和分子對接驗證了相互作用。 

Patching SG[6]研究了 SPR 技術(shù)在 G 蛋白偶聯(lián)受體配體篩選中的應用，通過(guò)分子垂釣篩選出與特定 G 蛋白偶聯(lián)受體具有高親和力的配體分子，為開(kāi)發(fā)針對該類(lèi)受體的藥物提供了重要的篩選工具。上海 第二軍醫大學(xué)藥學(xué)院 Cao Y 等[7]描述了一種基于 SPR 的靈敏、高效、便捷的方法的建立和應用，用于 從中草藥中篩選靶向腫瘤壞死因子受體 1 型(TNF-R1)的活性成分。調整中草藥提取物濃度進(jìn)行 SPR 結合試驗，在大黃提取物中觀(guān)察到顯著(zhù)的響應信號。然后，回收、富集 TNF-R1 結合成分，并 通過(guò) UPLC-QTOF/MS 進(jìn)行分析,鑒定出 hyscon-8-O-β-D - 單葡萄糖苷(PMG)為生物活性化合物， 并通過(guò) SPR 親和力分析確定 PMG 對 TNF-R1 的親和力常數。 

3.2 生物醫學(xué)研究 

研究細胞內信號傳導通路時(shí)，依次固定不同的信號蛋白，垂釣與之相互作用的上下游蛋白，逐步勾 

勒出復雜的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò )，助力揭示細胞生理功能調控機制以及疾病發(fā)生發(fā)展的分子基礎 Alexis S,Ivanov 等人[8]使用了結合親和分子垂釣和后續質(zhì)譜的方法，研究了與固定化微粒體細胞色 素 b5(CYB5A)相互作用的人類(lèi)肝臟蛋白質(zhì)，結果表明直接分子垂釣適用于分析正常和病理條件下 的蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)相互作用，這對醫療領(lǐng)域中研究疾病狀態(tài)下的蛋白質(zhì)相互作用具有重要意義。石 河子大學(xué)新疆植物藥資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗室的研究團隊選擇 TNF-α為靶點(diǎn)，利用 TNF-α 芯 片，“垂釣” 中草藥提取物中的活性分子，并用 LC-MS 進(jìn)行鑒定得到 3 種活性分子，隨后測定了 三種活性分子與靶點(diǎn) TNF-α 的親和力，明確其結合能力，最終在細胞水平證明其 TNF-α 抑制劑 的作用。 

  針對特定疾病，將疑似生物標志物分子(如特定蛋白或核酸片段)固定于芯片，從患者血液、

腦脊液等生物樣本中垂釣與之結合的內源性分子，經(jīng)鑒定后發(fā)現新的生物標志物，用于疾病早期診

斷、病情監測及預后判斷。Savitha,K [9]使用 SPR 技術(shù)對乳腺癌進(jìn)行早期檢測。模擬結果顯示正常細胞和 癌細胞的波長(cháng)光譜發(fā)生明顯變化，這種基于 SPR 的傳感器非常靈敏，是生物醫學(xué)應用的最佳選擇。Huimin 

Lei[10]在霍奇金淋巴瘤(HL)的研究中，構建了一系列網(wǎng)絡(luò )模型，包括背景網(wǎng)絡(luò )、HL 基本網(wǎng)絡(luò )和特定于 HL 的網(wǎng)絡(luò )。通過(guò)分析這些網(wǎng)絡(luò )，研究了 HL 相關(guān)蛋白的連接特性。發(fā)現 HL 相關(guān)蛋白質(zhì)更可能彼此連接，并且作 為 HL 特定網(wǎng)絡(luò )的骨干，可以進(jìn)一步將 HL 特定網(wǎng)絡(luò )分為五個(gè)子網(wǎng)和 49 個(gè)蛋白質(zhì)，它們可能與 HL 密切相關(guān)。 此外，還發(fā)現蛋白質(zhì)對的共調度是 HL 特定網(wǎng)絡(luò )中蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò )上 miRNA 的主要調節模式。根據 miRNA 對蛋 白質(zhì)網(wǎng)絡(luò )的調節，鑒定出 5 個(gè)核心 miRNA 為潛在的 HL 診斷生物標志物。 

3.3 中藥研究 

鑒于中藥成分復雜多樣，SPR 技術(shù)提供了高效篩選途徑。以某單味中藥或復方提取物為樣品， 針對特定病癥相關(guān)靶標(如炎癥相關(guān)細胞因子受體)進(jìn)行垂釣，結合質(zhì)譜等技術(shù)可快速鎖定具有活 性的小分子成分，如從清熱解毒類(lèi)中藥中垂釣出黃酮類(lèi)、萜類(lèi)等抗炎活性成分。 

海軍醫科大學(xué)藥學(xué)院藥物代謝產(chǎn)物研究上海重點(diǎn)實(shí)驗室 Zhang Y 等[11]構建了基于表面等離子共 振技術(shù)(SPR)的雙靶點(diǎn)中草藥分析體系，將 Spike RBD 蛋白和 ACE2 蛋白分別偶聯(lián)在芯片的不同 通道上，“垂釣”出中草藥提取物中的活性分子，發(fā)現葛根素與 Spike RBD 蛋白、ACE2 蛋白都能 特異性結合。為探索中草藥活性成分的靶向疾病治療機制提供了一種新思路。 

福建省片仔癀天然醫藥研發(fā)企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗室聯(lián)合福建中醫藥大學(xué)[12]建立了一種基于 SPR 垂釣技 

術(shù)來(lái)分析安宮牛黃丸的質(zhì)量標志物的方法，利用 UPLC-Q-TOF-MS 分析安宮牛黃丸主要化學(xué)成分，采 用網(wǎng)絡(luò )藥理學(xué)預測潛在靶點(diǎn)，構建 STAT3 蛋白芯片進(jìn)行垂釣回收，分析鑒定出 10 種潛在的活性成 分，并確定了其對 STAT3 靶點(diǎn)的親和動(dòng)力學(xué)參數。海軍軍醫大學(xué)團隊[13]，將攜帶膜蛋白 CXCR4 的 慢病毒顆粒固定在 CM5 芯片上，對川芎、穿心蓮、苦楝子的草藥提取物進(jìn)行 SPR 分子垂釣，串聯(lián) UPLC-QTOF-MS 技術(shù)，鑒定到來(lái)源于川芎的洋川芎內酯 I，并證明其與 CXCR4 蛋白的相互作用。第 二軍醫大學(xué)聯(lián)合上海大學(xué)團隊[14]，分別將 TNF-R1、TNF-α 偶聯(lián)到 CM5 芯片上，表征芯片活性和特 異性后，將白芍提取物按照不同比例稀釋后進(jìn)樣，垂釣回收與 TNF-R1 結合的成分，再通過(guò) UPLC- QTOF/MS 分析鑒定，最后用 SPR 技術(shù)進(jìn)一步確認芍藥苷和丹皮酚與 TNF-R1 的相互作用。 

確定中藥活性成分后，進(jìn)一步利用 SPR 精確測定其與靶標的親和力、結合位點(diǎn)等細節，結合細 胞實(shí)驗和動(dòng)物模型，深入解析中藥成分如何通過(guò)干預靶標分子發(fā)揮藥效，揭開(kāi)中藥傳統理論的現代 科學(xué)內涵，推動(dòng)中藥現代化進(jìn)程。 

4、基于 SPR 的分子垂釣實(shí)驗關(guān)鍵因素 

4.1 靶標分子的選擇與固定 

依據研究目的，優(yōu)先選擇與疾病緊密關(guān)聯(lián)、功能明確且具有可成藥性的分子作為靶標。例如在 腫瘤研究中，常聚焦于癌基因產(chǎn)物、腫瘤抑制因子等;在抗感染研究中，則選取病原體關(guān)鍵入侵蛋 白或宿主免疫相關(guān)受體?；瘜W(xué)偶聯(lián)法可實(shí)現牢固結合，常用 NHS/EDC 等試劑，不過(guò)操作需精細控制 避免影響靶標活性，需根據靶標特性靈活抉擇。 

4.2 樣品制備與處理 

高純度樣品能減少非特異性吸附干擾，提高信號的準確性。對于生物樣本，需通過(guò)超濾、色譜 等技術(shù)去除雜蛋白、核酸等雜質(zhì);對于化學(xué)合成樣品，要嚴格控制合成副產(chǎn)物含量。同時(shí)緩沖液的 pH 值、離子強度、滲透壓等參數對分子間相互作用也影響顯著(zhù)。合適的緩沖液應模擬生理環(huán)境，維 持靶標與待測分子的活性，同時(shí)避免促進(jìn)非特異性結合，通常需經(jīng)過(guò)預實(shí)驗優(yōu)化篩選。 

4.3 實(shí)驗設計與數據分析 

  設立陰性對照(如僅固定基質(zhì)無(wú)靶標分子)和陽(yáng)性對照(已知強結合物與靶標組合)，有效甄別假陽(yáng)性與假陰性結果，確保實(shí)驗數據的可靠性。然后依據 SPR 儀器輸出的傳感圖，運用專(zhuān) 

業(yè)軟件(如 SPR Analysis )擬合曲線(xiàn)，準確計算動(dòng)力學(xué)參數、親和力數據，結合統計學(xué)方法深入挖 掘數據背后的生物學(xué)意義。 

5、基于 SPR 的分子垂釣的優(yōu)勢與局限性 

5.1 SPR 技術(shù)在分子垂釣中的優(yōu)勢 

5.1.1 高效性:表面等離子體共振(SPR)生物傳感器是一種高效的儀器，適用于分子相互作用 的直接實(shí)時(shí)配準，而無(wú)需額外使用任何標簽或偶聯(lián)方法[11]，可以快速、準確地檢測分子間的相互作 用，提高了分析的效率。例如，在研究復雜生物系統中分子間相互作用時(shí)，SPR 生物傳感器能夠快 速篩選出潛在的相互作用分子，為后續的研究提供了有力的支持。 

5.1.2 特異性強:SPR 技術(shù)在分析各種配體受體相互作用時(shí)特別有效。這是因為 SPR 生物傳感 器能夠檢測到分子間的特異性結合，從而排除非特異性結合的干擾。例如，在蛋白質(zhì)相互作用的研 究中，SPR 技術(shù)可以準確地檢測到特定蛋白質(zhì)之間的相互作用，為研究蛋白質(zhì)的功能提供了重要的 依據。 

5.1.3 微量檢測:SPR 技術(shù)具有微量檢測的優(yōu)點(diǎn)，能夠檢測到極少量的生物分子[12]。這對于研究 生物體內微量的生物分子相互作用具有重要的意義。例如，在研究細胞信號傳導、受體-配體、抗 體-抗原分子垂釣等生命科學(xué)領(lǐng)域時(shí)，SPR 技術(shù)可以檢測到微量的生物分子，為研究這些領(lǐng)域提供了 有力的工具。 

5.1.4 實(shí)時(shí)監測:SPR 技術(shù)能夠實(shí)時(shí)監測分子間的相互作用，為研究分子間的動(dòng)態(tài)變化提供了有 力的支持[11]。例如，在研究蛋白質(zhì)相互作用的動(dòng)力學(xué)過(guò)程中，SPR 技術(shù)可以實(shí)時(shí)監測蛋白質(zhì)之間的 結合和解離過(guò)程，為研究蛋白質(zhì)的功能提供了重要的依據。 

5.1.5 適用性廣:SPR 技術(shù)已被廣泛應用于蛋白質(zhì)組學(xué)、細胞信號傳導、受體-配體、抗體-抗原 分子垂釣、免疫識別、癌癥研究和新藥篩選等生命科學(xué)領(lǐng)域。這表明 SPR 技術(shù)具有廣泛的適用性， 可以應用于不同的研究領(lǐng)域。例如，在海洋糖類(lèi)物質(zhì)的活性研究中，SPR 技術(shù)已成功用于海洋糖類(lèi) 化合物作用靶點(diǎn)確定、親和力測定及糖類(lèi)抗體研究等方面[13]。 

5.2 SPR 技術(shù)在分子垂釣中的局限性 

5.2.1 復雜樣品分析困境:面對生物體內高度復雜的樣本(如全血、組織勻漿)，非特異性吸附嚴重，信號易受干擾，精準識別特異性結合信號難度大增。 

5.2.2 通量瓶頸:傳統 SPR 設備單次檢測樣本量有限，在大規?；衔锖Y選、多靶標平行研究 場(chǎng)景下效率較低，難以滿(mǎn)足高通量需求。 

6、展望 

6.1 技術(shù)聯(lián)用突破:與微流控技術(shù)結合，實(shí)現樣品微量化、自動(dòng)化處理，降低非特異性吸附;與 質(zhì)譜聯(lián)用，實(shí)時(shí)鑒定垂釣所得分子，拓展信息獲取維度，提升復雜樣品分析能力。 

6.2 高通量設備革新:研發(fā)新一代高通量 SPR 系統，同步檢測多個(gè)樣本或靶標，大幅提升通 量，加速藥物研發(fā)與生物標志物發(fā)現進(jìn)程。 

6.3 普及應用推進(jìn):通過(guò)技術(shù)改進(jìn)、規?；a(chǎn)降低成本，開(kāi)發(fā)操作簡(jiǎn)易的儀器平臺，配套完善 的培訓服務(wù)，促使 SPR 技術(shù)在更多領(lǐng)域生根發(fā)芽，助力科研與產(chǎn)業(yè)發(fā)展。 

7、結論 

SPR 技術(shù)在分子垂釣領(lǐng)域已取得豐碩成果，廣泛滲透至藥物研發(fā)、生物醫學(xué)、中藥研究等核心 陣地，為破解分子相互作用謎題提供關(guān)鍵支撐。盡管當前面臨復雜樣品、通量及成本等挑戰，但隨 著(zhù)技術(shù)創(chuàng )新與聯(lián)用策略的深入實(shí)施，未來(lái)有望迎來(lái)新的飛躍，持續為生命科學(xué)前沿探索與應用轉化 注入強大動(dòng)力。 

8、參考文獻 

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